Perché eseguire la compensazione?


La compensazione è il processo della sottrazione dello straripamento dello spettro di un fluorocromo nel canale di rilevazione di un altro.

        

Sovrapposizione degli spettri di emissione di fluorocromi


 

Un esempio di sovrapposizione spettrale può essere osservata tra FITC e PE. La fluorescenza causata dal FITC durante una singola procedura di colorazione deve essere sottratta o compensata dal canale del PE.

Come viene eseguita una compensazione?
• Impostare il  voltaggio dei PMT.
• Rilevare l’autofluorescenza per ogni fluorocromo nel pannello.
• impostare i controlli a singolo colore per ogni fluorocromo nel pannello.

Quali possono essere i controlli a singolo colore?
• Le cellule
• Biglie di compensazione

Mentre le cellule possono sembrare una buona scelta, le biglie sono una valida alternativa, quando le cellule possono essere limitate o l'antigene di interesse è espresso a bassi livelli.

Punti di compensazione da considerare:
• Sempre preparare un tubo di cellule non colorate per settare i voltaggi dei PMT.
• Non utilizzare un tubo di biglie negative per impostare i voltaggi.

 

 

Lo spettro del CD4 PE si riversa pesantemente nel canale del PerCP-eFluor 710

 

Man mano che la compensazione viene applicate il sengale del PE nel canale del PerCP-eFluor 710 si riduce.

                       

 

La compensazione corretta si ottiene quando le popolazioni positive e negative per il PE hanno la stessa intensità media equivalente di fluorescenza (MFI) rispetto al PerCP-eFluor 710.

 

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