FAQ ELISA

Cos'è un ELISA?
Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISAs) è un tecnica, per la quantificazione di proteine che riesce a combinare la specificità di un anticorpo con la sensibilità di un semplice saggio enzimatico, utilizzando anticorpi o antigeni coniugati con enzimi.
Uno dei saggi più utilizzati in Elisa è la tecnica "sandwich"; questo tipo di saggio è utilizzato per determinare la concentrazione di antigeni in campioni sconosciuti.

Introduzione al Metodo Elisa (Sandwich)
Un sistema "classico" Elisa comprende dei campioni, un anticorpo di cattura, un anticorpo biotinilato di rilevamento, della streptavidina-HRP coniugata(SAV), cromogeno e soluzione di bloccaggio.
L’antigene si legherà all’anticorpo di cattura adeso sulla base solida ed all’anticorpo di rilevamento biotinilato.
La semina del SAV, che si legherà all’anticorpo di rilevamento, completerà il "sandwich".
Una soluzione di substrato sarà quindi aggiunta, sviluppando un colore prodotto dalla reazione dell’anticorpo precedentemente legato a SAV.
La variazione dell’intensità di colore sarà direttamente proporzionata alla quantità d’antigene presente nel campione

Tipologie di Elisa
Si possono riconoscere diverse tipologie di Elisa:

• Elisa Diretto: l’antigene viene direttamente adeso alla base solida (pozzetto), seguito da un anticorpo direttamente marcato con un enzima.
• Elisa Indiretto: l’antigene anche in questo caso viene direttamente adeso alla base solida ma in questo caso l’anticorpo primario non sarà direttamente marcato, ma un anticorpo secondario marcato, specifico contro quello primario, verrà aggiunto. Questo sistema viene scelto perché particolarmente efficace per la quantificazione da campioni di siero.
• Elisa Competitivo: prevede l’aggiunta simultanea di anticorpi o proteine in competizione tra loro. Avremo un risultato altamente specifico.
• Elisa a Sandwich: un anticorpo, detto di cattura, viene adeso alla base solida. I campioni saranno quindi aggiunti, con una specifica soluzione tampone per ridurre al minimo l’adesione al pozzetto. Infine un anticorpo secondario, marcato con un enzima, svilupperà la quantificazione. Il sistema a Sandwich è sicuramente il sistema più sensibile e specifico per il rilevamento di basse quantità d’antigene.

Domande frequenti

1) Qual'è la differenza fra i pozzetti dello "zero standard" e "bianco"?
I pozzetti "zero standard" sono il punto più basso sulla curva standard, cioè sono preparati con la curva standard ma non contengono lo standard. Il pozzetti "bianchi" sono il "controllo della piastra" ,ciò che permette all'utente, di sottrarre il "colore aspecifico" del liquido (= soluzioni di substrato + stop) e della plastica, dalle letture. L'assorbanza ottica del bianco dovrebbe essere sempre più basso dello "zero standard". Il limite massimo dello "zero standard" dovrebbe essere 0,200. Nel caso in cui gli "zero standard" fossero più alti del 0,200, bisognerà controllare se c'è contaminazione del cromogeno o problemi legati alla plastica del pozzetto, facendo la lettura di un pozzetto vuoto.

2) Posso diluire lo standard nel terreno di coltura?
Gli standard all'interno dei kit CytoScreen ELISA sono stati specificamente sviluppati per essere diluiti nel tampone diluente fornito nel kit. Se il cliente usa un altro terreno per la diluizione dello standard, potrà o non potrà avere una buona curva standard e non garantire la validità del risultato.

3) Quando arresto la reazione se ottenessi una lettura "Alta" al mio primo tentativo?
Le reazioni del cromogeno sono reazioni lineari e l'Assorbanza Ottica aumenta linearmente al tempo. Dipende da quando la piastra è stata bloccata (nello sviluppo colorimetrico), per esempio se al primo tentativo avete atteso 20 minuti, provate 15 minuti al tentativo seguente. Una seconda opzione potrebbe essere diluire i campioni fuori scala e rileggerli.

4) Per quanto tempo sarà, il mio coniugato di SAV, "buono", se mi fossi dimenticato di metterlo a -20° C, dopo averlo ricevuto?Il coniugato concentrato della streptavidina può essere conservato a +4/8°C (refrigerato) fino alla data di scadenza indicata sul kit

5) Per quanto tempo sarà, il mio standard, "buono", se mi fossi dimenticato di metterlo a -20° C, dopo averlo ricevuto?
Poiché lo standard è fornito liofilizzato, esso non richiede un congelamento iniziale per mantenerne la vitalità. Dopo la sua ricostituzione, eliminate tutto lo standard restante inutilizzato. Ci sono 4 standard liofilizzati forniti in ogni kit.

6) Il kit è ancora valido dopo la data di scadenza indicata? Quanto tempo?
No è sconsigliato usare i kit Cytoscreen dopo la scadenza indicata.

7) Se i miei risultati fossero troppo alti (oltre la capacità del mio spettro-fotometro), c'è un sistema leggere comunque i dati?
Si. Se saranno solo pochi pozzetti della piastra ad essere fuori dalla Assorbanza Ottica, prelevare 100ml (precisi) di cromogeno e sostituirli con 100ml di acqua distillata. Quindi rileggere e moltiplicare l'Assorbanza ottica per 2. Questa procedura potrà essere ripetuta. Successivamente, è consigliato diluire i propri campioni sulla base di questi risultati e ripeterne la lettura.

8) Se diluisco la soluzione bloccante, devo usare più soluzione bloccante o posso usare altro?
Come spiegato nel punto precedente, acqua distillata.

9) Cosa accadrebbe se avessi rovesciato il mio anticorpo Biotinilato (o un altro componente)?
Singole fiale di ogni componente sono disponibili a prezzi speciali.

10) Cosa succede se aggiungo il reagente sbagliato al momento sbagliato (per esempio la SAV al posto dell'anticorpo biotinilato)?
Lo sviluppo del kit potrebbe essere salvato se venisse immediatamente aspirato il reagente sbagliato, asciugato, ed inserito il giusto componente.

11) Se mi fossi dimenticato di incubare la piastra a 37°C?
Si potrebbe aumentare il periodo di incubazione se si scoprisse l'errore prima del passaggio successivo, aumentandolo fino al doppio del tempo previsto, a temperatura ambiente.

12) Cosa accadrebbe se il mio lavatore automatico mal funzionasse o lavasse più delle 4 volte previste?
Proseguire nell'esecuzione del kit, seguendone il protocollo. I risultati potrebbero essere lievemente inferiori o normali.

13) Cosa succede se il mio lettore non legge automaticamente il "bianco" nel pozzetto A1?
Potrete leggere la piastra normalmente, ma dovrete sottrarre manualmente il "bianco" qualora desse un risultato, per esempio 0,002.

14) Devo fare una curva di calibrazione ad ogni corsa o ad ogni piastra?
Teoricamente, se non venisse processata una curva di calibrazione ad ogni corsa e in ogni piastra, non vi sarebbe la possibilità di confermarne il risultato. Tuttavia potrebbe essere valida la costruzione della curva di calibrazione nella prima piastra e la semina di 2 soli punti (basso ed alto) nelle piastre successive.

15) Cosa vuol dire se la confezione di conservante all'interno della confezione della piastra risulta colorato?
Significa che la piastra è stata a contatto con umidità causata dalla refrigerazione. In questo caso non sarà opportuno usare la piastra. Qualora si usasse la piastra in più di una seduta, si consiglia di prestare molta attenzione alla chiusura di quest'ultima.

16) Posso lasciare la mia piastra per tutta la notte a 4°C, se si, a quale punto del protocollo?
Durante il primo step, dopo aver seminato la piastra con i campioni, incubare come indicato a 37°C o temperatura ambiente, quindi mettete la piastra ben sigillata a 4°C per tutta la notte. La mattina successiva attenderete che la piastra sia tornata alla temperatura d'ambiente prima di passare alla step n° 2.

17) Posso scambiare i componenti di un kit con quelli di un altro o dello stesso kit ma di lotto differente?
NO. Solo il tampone di lavaggio può essere condiviso tra diversi kit. Attenzione, perché lo scambio tra i componenti di diversi kit porta ad errori nei risultati.

18) Posso acquistare separatamente le piastre di un kit?
No, non è possibile ci dispiace

19) E' possibile l'uso di un filtro a 490 nm invece di quello a 450 nm? Cosa faccio se non è disponibile il filtro a 450nm?
No. La lunghezza d'onda necessari per leggere la colorazione prodotta dal substrato, fermato dalla soluzione bloccante, dovrà essere letto a 450 nm. E' importante controllare, preventivamente all'esecuzione del kit, la disponibilità di un lettore con filtro a 450nm.